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May 18, 2023

Estructura de la solución de Pvfp recombinante

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 739 (2022) Citar este artículo

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Algunos organismos marinos pueden resistir los ambientes acuosos de las mareas y adherirse firmemente a la superficie húmeda. Este comportamiento ha llamado la atención cada vez más sobre posibles aplicaciones en medicina, biomateriales e ingeniería de tejidos. En los mejillones, las fuerzas adhesivas a la roca son el resultado de formaciones fibrosas proteicas llamadas byssus. Presentamos la estructura en solución de Pvfp-5β, una de las tres proteínas de placa bisal secretadas por el mejillón verde asiático Perna viridis, y el componente responsable de iniciar interacciones con el sustrato. Demostramos que Pvfp-5β tiene una estructura plegada de forma estable de acuerdo con la presencia en la secuencia de dos motivos EGF. La estructura es muy rígida, excepto por unos pocos residuos afectados por movimientos locales lentos en la escala de tiempo µs-ms, y difiere del modelo calculado por métodos de inteligencia artificial para la orientación relativa de los módulos EGF, que es algo en lo que los métodos computacionales todavía tienen un rendimiento inferior. . También mostramos que Pvfp-5β es capaz de coacervar incluso sin modificación de DOPA, lo que brinda información tanto para comprender el mecanismo de adhesión de las proteínas de mejillón adhesivas como para desarrollar biomateriales.

Cómo los organismos marinos, como los mejillones, las estrellas de mar y los gusanos de los castillos de arena, logran adherirse tan firmemente a las superficies húmedas como para resistir la fuerza de las mareas y las olas tormentosas es un tema de creciente interés1. Esto no se debe solo a la importancia de esta propiedad para la industria naval, para la cual la contaminación biológica de la superficie es una preocupación importante, ya que acelera la corrosión de la superficie que requiere un mantenimiento de la superficie costoso. Aún más interesantes son las implicaciones que podría tener una comprensión completa de un mecanismo de adherencia tan estricto para el desarrollo de nuevos biomateriales con propiedades que podrían explotarse en medicina regenerativa, ingeniería de tejidos y ciencia de materiales2,3.

Entre los organismos marinos con propiedades de adhesión se encuentran los mejillones que han desarrollado una estrategia para una fuerte adhesión bajo el agua a través de la secreción de un apéndice fibroso a base de proteínas llamado byssus. Está formado por filamentos formados por haces de fibras entrelazadas entre sí4. Cada filamento termina con una placa rica en proteínas, que contiene proteínas de pie de mejillón (mfps) caracterizadas por características adhesivas, que actúa como un pegamento resistente al agua y permite que la fibra se ancle firmemente a diferentes sustratos5,6. Químicamente, la composición del biso consta de varias proteínas diferentes que se sintetizan en el pie del mejillón, un órgano grande que en agua dulce permite que el mejillón atraviese el sustrato y se mueva. El biso se produce en un surco en la superficie ventral del pie y exuda como una secreción viscosa, que gradualmente se endurece y forma fibras al contacto con el agua, en un proceso de coacervación que tiene analogías con la formación de las fibras amiloides de los péptidos Abeta7.

Se han identificado seis proteínas de pie de mejillón en el género Mytilus más estudiado (mfp-2, -3S, -3F, -4, -5 y -6)8. Las proteínas de este organismo tienen energías de adhesión débiles (<5 mN/m) y la peculiaridad de ser biodegradables y por tanto respetuosas con el medio ambiente9, normalmente no tóxicas y con propiedades de respuesta inmune bajas10. Una peculiaridad de las proteínas de pie de mejillón es que contienen el aminoácido catecólico 3,4-dihidroxi-l-fenilalanina (DOPA), un derivado de la tirosina obtenido por modificación postraduccional11. Se sabe que DOPA se une a una amplia variedad de sustratos a través de su capacidad para formar enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, coordinación de metales y enlaces covalentes12,13,14,15,16 y, por lo tanto, muchos estudios se han centrado hasta ahora en polímeros derivados de DOPA para desarrollo de nuevos biomateriales adhesivos.

En un estudio previo, hemos caracterizado la versión no modificada por DOPA de una de las proteínas mfp del mejillón verde asiático Perna viridis (Pvfp-5β)17. Entre las proteínas producidas por este organismo que también incluyen Pvfp-3α y Pvfp-6, la Pvfp-5β es la primera en ser secretada y en establecer interacción con el sustrato convirtiéndola en un sistema de particular interés18. La secuencia de esta proteína contiene dos repeticiones en tándem con alta homología con los módulos EGF y comparte 47–50% de identidad con las repeticiones EGF de la proteína 1 similar a Δ del ligando de Notch17,18. Los motivos EGF son proteínas all-β caracterizadas por tres puentes disulfuro conservados, que pueden unir iones de calcio, y también se han observado en otras proteínas adhesivas de mejillón, como Mgfp-2 de Mytilus galloprovincialis12,19,20. Demostramos que es posible producir Pvfp-5β recombinante en bacterias y que Pvfp-5β tiene baja toxicidad y propiedades adhesivas intrínsecas también en ausencia de modificaciones de DOPA17, lo que reconforta la posibilidad de utilizar esta proteína como biomaterial de recubrimiento superficial para aplicaciones médicas, incluida la regeneración de tejidos dañados. Estos resultados también han sido respaldados por otros estudios, que han demostrado que los residuos sustituidos con DOPA no son necesarios para producir una fuerte adhesión resistente a la humedad, y las proteínas DOPAminadas no tienen propiedades adhesivas más altas que las correspondientes versiones no DOPAminadas5,21, 22 Nuestros resultados también se alinean con estudios recientes que destacaron la importancia de los residuos de lisina (Lys) en la adhesión de los mejillones23,24,25,26. De hecho, tanto la DOPA como la tirosina son propensas a formar enlaces catión-π con residuos flanqueantes cargados positivamente, como la lisina, que se cree que aumenta la fuerza cohesiva de las capas adsorbidas de mfps e induce una separación espontánea de fases líquido-líquido de un compuesto rico en proteínas. fase fluida (coacervación compleja) en soluciones salinas27,28,29.

Más recientemente, otro estudio mostró que tanto el Pvfp-5β modificado con DOPA como el no modificado están en gran medida desestructurados y que solo el Pvfp-5β modificado con DOPA mostró separación de fase líquido-líquido (LLPS) en condiciones similares al agua de mar, mientras que el La versión solo Tyr forma solo agregados insolubles30. Estos resultados, que difieren de nuestros datos, abren dos preguntas importantes: si las proteínas fueran a estar desestructuradas, ¿por qué Nature ha utilizado el pliegue EGF, que se sabe que se pliega de forma estable también gracias a los puentes disulfuro? ¿Es DOPA el único paradigma para desarrollar nuevos bioadhesivos inspirados en mejillones?

Para explorar estos asuntos, dimos otro paso importante hacia la posibilidad de comprender los determinantes estructurales de las propiedades adhesivas de Pvfp-5β resolviendo su estructura tridimensional en solución y estableciendo que, a pesar de la ausencia de un núcleo hidrofóbico adecuado, la estructura en solución es relativamente rígido con sólo movimientos lentos locales. También demostramos experimentalmente que Pvfp-5β sin modificar puede someterse a una coacervación simple a pH neutro o básico, y representamos el proceso de coacervación causado por el autoensamblaje de Pvfp-5β mediante acoplamiento molecular.

Nuestros resultados proporcionan las bases para obtener una mejor comprensión de los determinantes estructurales de las propiedades de adhesión de las proteínas del mejillón.

Nuestro espectro 2D 1H–15N HSQC NMR de Pvfp-5β sin modificar deja pocas dudas de que la proteína está plegada de manera estable y es monomérica, mostrando picos de dispersión en un rango de 9.7–6.7 ppm (Fig. S1 complementaria) 17. Entonces decidimos proceder con la determinación de la estructura de RMN tridimensional en solución de Pvfp-5β. Es de destacar que el espectro HSQC de nuestra Pvfp-5β recombinante es bastante diferente del publicado recientemente por otro grupo que es consistente con una proteína mayoritariamente no estructurada30. La determinación de la estructura de RMN tridimensional en solución de Pvfp-5β no fue una tarea fácil a pesar del pequeño tamaño de la proteína. Esto se debe a que la asignación de espectros de RMN requirió un esfuerzo formidable debido al alto contenido de tirosinas (20,5%) y prolinas (9,6%). Sin embargo, se pudo lograr una asignación virtualmente completa (Fig. S1 complementaria) y, a excepción de Pro12, casi todas las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos de Pvfp-5β se asignaron con éxito. La asignación se envió a la base de datos BMRB con el número de acceso 51091.

Curiosamente, notamos que los cambios químicos de las doce cisteínas tienen todos los valores compatibles con sus formas oxidadas (Tabla complementaria 1), en desacuerdo con nuestra determinación previa de los puentes disulfuro por espectrometría de masas, que había confirmado la formación de solo cinco de los seis posibles puentes17. Sin embargo, notamos que algunas resonancias de residuos a lo largo de toda la cadena tienen desviaciones bastante grandes de los valores esperados. Por lo tanto, por precaución, primero ejecutamos los cálculos de ARIA imponiendo solo los cinco enlaces disulfuro encontrados por MS: C13–C29, C31–C40, C45–C56, C50–C67 y C69–C7817. Las 20 estructuras energéticamente mejores resultantes tenían una desviación cuadrática media (RMSD) de la columna vertebral de 1,43 +/– 0,39 Å considerando todos los residuos, y 1,17 +/– 0,25 Å considerando solo los residuos involucrados en tractos ordenados (3–4, 6 , 8–34 36–38, 41–59 y 61–82). Se notaron ocho violaciones de las restricciones de distancia por encima de 0.5 Å en el conjunto estructural final junto con una mala superposición para los traics 1–11 y 18–30 (Fig. S2 complementaria).

La estructura general de Pvfp-5β está de acuerdo con lo que se esperaba de los criterios de homología, mostrando la presencia de dos módulos EGF en tándem formados por dos láminas β antiparalelas expuestas a solventes y regiones de bobinas aleatorias unidas por los puentes disulfuro (Figura complementaria S2 ). El primer módulo contiene solo dos de los tres puentes disulfuro esperados para un dominio similar a EGF (C13–C29, C31–C40), mientras que el segundo módulo contiene tres puentes disulfuro como se esperaba (C45–C56, C50–C67 y C69– C78). La parte restante de la estructura se caracteriza por largas regiones de espirales aleatorias. Estos resultados preliminares confirman y amplían las predicciones anteriores y prueban sin lugar a dudas que la proteína está plegada y estructurada.

Para investigar sobre las propiedades dinámicas de la proteína y concomitantemente sobre la presencia del sexto puente disulfuro, estudiamos la relajación de la proteína en la escala de tiempo ps-ns. A pesar de que Pvfp-5β contiene solo unos pocos elementos de estructura secundaria, los datos de relajación indican una proteína relativamente rígida, como lo revelan los valores uniformes de 15N-R1, 15N-R2 y hetNOE, tanto a 14,1 como a 18,8 T (Fig. 1). Se observaron valores elevados de 15N-R2 junto con R1 bajo y valores de hetNOE relativamente altos para los residuos C8, N39, Y42, C45, G72, Q77 y Q79, todos pertenecientes a regiones no estructuradas y/o bucles, y para los residuos T18 e Y27 pertenecientes a a β1 y β2, respectivamente. Esto indica que no hay movimientos locales rápidos dentro de la escala de tiempo de μs-ms para estos residuos.

Relación 15N-R1, 15N-R2, hetNOE y R2/R1 a 298 K medida para todos los residuos de Pvfp-5β a 14,1 T (puntos azules) y 18,8 T (puntos rojos). Las hebras β se indican como flechas azules en la parte superior de la figura, mientras que las curvas amarillas indican enlaces disulfuro. Los asteriscos negros indican residuos de prolina o residuos con picos superpuestos en los experimentos de RMN. En negrita residuos que muestran movimientos locales no rápidos dentro de la escala ms-μs.

Para confirmar que las características dinámicas observadas son intrínsecas a la proteína e independientes de las condiciones experimentales, repetimos los experimentos de relajación a diferentes temperaturas (288, 293 y 303 K) a 18,8 T. Las proporciones hetNOE y R2/R1 resultantes se trazaron para cada temperatura, y no mostró cambios en la tendencia general (Figura complementaria S3). Para una interpretación más confiable de los datos, también analizamos los datos utilizando el enfoque de mapa de densidad espectral reducida, que brinda una imagen cualitativa imparcial de los movimientos de proteínas 31 (Fig. S4 complementaria). De acuerdo con este análisis, Pvfp-5β exhibe un patrón típico de una proteína rígida, con solo los residuos 2–4 y 83 identificables como flexibles con poca restricción de los movimientos del vector N–H de la columna vertebral. Los residuos C8 y T18 experimentan un intercambio conformacional en la escala de tiempo de μs-ms, lo que respalda la presencia del sexto puente disulfuro entre C8 y C19. Por lo tanto, concluimos que nuestros resultados anteriores de MS, que eran relativos a Pvfp-5β marcado con His, deben haberse visto afectados por la presencia de la etiqueta N-terminal, que podría haber influido en el potencial redox de la cisteína C8 N-terminal. Los residuos Y27, N39, G72 y Q77 también experimentan un intercambio conformacional en la escala de tiempo μs-ms, mientras que los residuos N6, G23 y G61 aparecieron en una situación intermedia entre flexible y rígido, aún experimentando un movimiento rápido hacia un valor bajo de J(0 ).

Se obtuvo un tiempo de correlación de 7,8 ns a partir de las proporciones T1/T2 de 27 residuos con valores T1 y T2 dentro de 1 unidad de desviación estándar del promedio. Este valor es ligeramente más largo de lo esperado para una proteína globular monomérica de 9,5 KDa, pero esto se justifica por la forma elipsoidal alargada de Pvfp-5β, como lo confirma la relación DII/DI (1,3) del tensor de difusión derivado de la dependencia de la orientación de R2/R1, lo que indica anisotropía32.

Estas observaciones proporcionan información invaluable sobre la dinámica de la proteína y nos llevan a concluir que Pvfp-5β es una proteína monomérica a pH ácido, aunque tiene una fuerte tendencia a agregarse a pH neutro y básico.

Se realizó un segundo cálculo de estructura imponiendo el puente disulfuro adicional C8-C19 encontrado por nuestros estudios dinámicos. Las 20 estructuras energéticamente mejores de Pvfp-5β tienen un RMSD de 1,42 +/– 0,5 Å para los átomos de la columna vertebral de todos los residuos, y de 1,09 +/– 0,29 Å solo en los átomos de la columna vertebral de los residuos ordenados 3–4, 6– 82 (Fig. 2 y Tabla 1). El nuevo conjunto estructural dio como resultado un menor grado de variabilidad en el N-terminal largo de acuerdo con los datos de relajación, la desaparición de algunas violaciones consistentes y una definición totalmente mejor del haz de RMN de acuerdo con el perfil de relajación. La presencia del enlace disulfuro adicional C8-C19 en medio de una bobina aleatoria N-terminal explica los valores más altos de 15N-R2 y hetNOE y la presencia de la contribución de intercambio en el residuo C8, así como el orden parcial del tracto 9- dieciséis. Por lo tanto, podemos considerar este paquete como la estructura representativa de Pvfp-5β. Las coordenadas de la estructura se han depositado en el Protein Data Bank con el código de acceso 7QAB.

a Superposición de las 20 estructuras de menor energía. b Representación de dibujos animados de la estructura a la energía más baja con puentes disulfuro en amarillo. c Representación de dibujos animados de la estructura en la energía más baja con tirosinas, lisinas y argininas resaltadas en naranja, azul y magenta, respectivamente. d Potencial electrostático superficial con residuos ácidos en rojo y básicos en azul. e Superficie hidrofóbica.

Al igual que en otras proteínas similares a EGF, Pvfp-5β carece casi por completo de un núcleo hidrofóbico, como también lo confirma nuestro análisis de los coeficientes de temperatura definidos como las proporciones dδHN/dT detectadas en el rango de 283–303 K (Figura complementaria S5). Cuando se muestra la molécula alargada a lo largo del eje largo, una de las dos superficies opuestas está principalmente cargada positivamente (Fig. 2d). Las mezclas de tirosinas y lisinas se distribuyen a lo largo de toda la proteína (Fig. 2c). Como era de esperar, la mayoría de los residuos ubicados en regiones no estructuradas y bucles presentaron dδHN/dT < –5 ppb/K, lo que sugiere enlaces de H sueltos33. También se obtuvieron valores de dδHN/dT < –5 ppb/K para los residuos K21, Y27, C56 y C67 que pertenecen a ambas hojas β e indican la exposición de estos residuos al solvente. Los residuos T18, K20, R22, S26, K28, Y30, G57, Y64, Y65, K66 y S68, todos en regiones de hoja β, presentaron dδHN/dT > –5 ppb/K, lo que confirma su participación en elementos de estructura secundaria y estable. enlaces H. También se observaron valores de dδHN / dT> -5 para algunos residuos ubicados en giros en U entre hojas β, en los bucles y en las colas N y C de acuerdo con una estructura general relativamente rígida (Figura complementaria S5 ).

Como medio de validación de la estructura, modelamos Pvfp-5β por Inteligencia Artificial (IA) utilizando el software RoseTTAFold en el servidor Robetta34,35. Obtuvimos cinco modelos con altos valores de confianza (0,92) y con los seis puentes disulfuro. La comparación de estos modelos con el conjunto estructural experimental final muestra solo diferencias menores interesantes en la interfaz entre los dos módulos similares a EGF, que es ligeramente diferente debido a una diferencia en el bucle β3-β4 (Fig. S6 complementaria). Sin embargo, la estructura experimental de RMN está directamente respaldada por NOE inequívocos entre las dos repeticiones y brinda un grado de detalles que difícilmente se puede esperar de la naturaleza misma de las técnicas de aprendizaje automático. A pesar de la enorme capacidad de la inteligencia artificial para predecir la estructura, puede haber detalles que aún estén por encima de la predicción.

En un estudio anterior, demostramos por dispersión de luz dinámica (DLS) que Pvfp-5β tiene propensión a agregarse en condiciones de choque de pH17. En el presente trabajo, analizamos el proceso de autoensamblaje de Pvfp-5β mediante el colorante fluorescente ThioflavinT (ThT), que es sensible a la formación de estructuras β intermoleculares en las fibrillas de amiloide36 y se acumula en los coacervados37,38. La fluorescencia de ThT se controló mediante microscopía confocal y microscopía de imágenes de vida útil de fluorescencia (FLIM) para detectar las diferentes especies formadas después de la exposición de los monómeros Pvfp-5β a diferentes pH.

La exposición de Pvfp-5β a un ambiente alcalino (Tris-HCl 0,1 M pH 8, NaCl 1 M) produce la aparición progresiva de tres especies proteicas principales. Se observa una aparición repentina de gotas de coacervación con un diámetro de aproximadamente 1 μm o menos poco después del insulto (Fig. S7a complementaria, Película complementaria). El monitoreo de la muestra durante 2 h revela la formación de especies positivas para ThT progresivamente más grandes con una apariencia final de estructuras fibrilares (Fig. S7b, c complementarias). Como control, la incubación de Pvfp-5β a pH 4.5 no da como resultado ninguna especie ThT-positiva (Fig. S7d complementaria).

Para aclarar la arquitectura estructural de los ensamblajes de proteínas a escala submicrónica y sondear la evolución de los cambios estructurales microscópicos, se utilizó FLIM para analizar el tiempo de vida de la fluorescencia ThT39. Esto tiene una sensibilidad específica a la polaridad ambiental, la presencia de residuos específicos (p. ej., compuestos aromáticos) o el espacio entre las cadenas β40. En un ambiente acuoso, ThT tiene una vida útil en el rango de picosegundos, mientras que una vida útil más larga se mide en medios con mayor viscosidad41. Las mediciones de FLIM se analizaron utilizando el enfoque fasorial, detallado en la sección Métodos, que brinda una visión global de la descomposición de las moléculas fluorescentes, sin imponer ningún modelo específico como lo requieren los procedimientos de ajuste (Fig. 3)42,43. Las mediciones en Pvfp-5β teñido con ThT en un entorno alcalino revelan tres distribuciones diferentes de vida útil de fluorescencia de ThT, identificadas como nubes de puntos distinguibles en el gráfico fasorial (Fig. 3a), cada una de las cuales corresponde a una de las tres especies principales positivas para ThT (gotas de coacervados, ensamblajes medianos y especies fibrilares). Cada tiempo de vida de ThT en la muestra de Pvfp-5β se caracteriza por un decaimiento exponencial doble, cuyos componentes principales tienen tiempos de vida característicos de τ1 = 0,4 ns y τ2 = 2,4 ns, encontrados previamente para estructuras amiloides teñidas con ThT (Fig. 3a)44. La descomposición más rápida se atribuyó a sitios de unión menos específicos. En estos casos, la fluorescencia de ThT se produce debido al aumento de la viscosidad ambiental. Las desintegraciones más lentas se atribuyeron a una interacción más específica entre ThT y las estructuras β intermoleculares que agregan más restricciones y menos flexibilidad al sitio de unión de ThT. Se midieron tiempos de vida más cortos para los condensados ​​de proteínas esféricas a microescala formados fácilmente, lo que revela su naturaleza de gotitas de coacervación (Fig. 3d). La vida útil de ThT aumenta progresivamente para las especies más grandes, lo que resulta más largo para las estructuras con morfología fibrilar, lo que indica estructuras β intermoleculares empaquetadas / densas (Fig. 3e, f). Estos resultados demuestran claramente que la Pvfp-5β no modificada exhibe LLPS en condiciones similares al agua de mar, a diferencia de un estudio reciente que muestra que solo la Pvfp-5β modificada con DOPA exhibió LLPS, mientras que la versión no modificada forma solo agregados insolubles30.

Análisis fasorial de mediciones FLIM de 256 × 256 píxeles en la señal ThT de 1 mg/ml de Pvfp-5β en Tris-HCl 0,1 M pH 8, NaCl 1 M. a Diagrama fasorial obtenido a partir de imágenes de las diferentes especies presentes en la muestra. Las coordenadas g y s corresponden a transformadas de seno y 30 coseno de cada punto en el gráfico fasorial, respectivamente. Tres distribuciones de tiempo de vida distinguibles, resaltadas por cursores circulares de colores, son evidentes y se encuentran en una línea recta (amarillo discontinuo) que conecta dos fasores de desintegración monoexponenciales con un tiempo de vida característico de 2,4 ns y 0,4 ns. b, c, d Imágenes de intensidad de fluorescencia, de baja intensidad (azul) a alta intensidad (rojo) de gotas de coacervado, agregados de tamaño mediano y fibrillas, respectivamente. e, f, g Mapas de vida útil: cada píxel se colorea de acuerdo con el código de color correspondiente del cursor que resalta las distribuciones de vida útil en el gráfico fasorial a).

Para obtener una impresión pictórica del proceso de coacervación de Pvfp-5β que ocurre en la adhesión del mejillón, utilizamos la estructura experimental de Pvfp-5β para realizar el acoplamiento molecular del dímero Pvfp-5β/Pvfp-5β para predecir qué superficie podría iniciar el autoensamblaje. . El acoplamiento del dímero por HADDOCK dio como resultado tres grupos, entre los cuales el primero es el más poblado (177 estructuras) con el mejor HADDOCK y Z-score con un RMSD total de 0,6 ± 0,3 Å de la estructura general de menor energía (Supplementary Tabla 2). Los dímeros resultantes se colocan de cabeza a cola con un eje de simetría D2 con un núcleo hidrofóbico bien estructurado que involucra Y27, Y62 e Y65 de ambos monómeros (Fig. 4). El complejo está estabilizado por una serie de interacciones π-π y catión-π y por una red extendida de enlaces de hidrógeno en la interfaz entre los dos monómeros (Tabla complementaria 3). El acoplamiento adicional entre los dímeros propone que podrían interactuar entre sí a través de tirosinas expuestas adicionales en la superficie externa del dímero. Esto implicaría una orientación de la estructura monomérica alargada perpendicular al eje de la fibra.

Estructura de energía más baja del dímero Pvfp-5β/Pvfp-5β según lo calculado por HADDOCK. una representación de dibujos animados con residuos de los dos componentes involucrados en la interacción mostrada en palos. b, c potencial de superficie electrostático para un monómero y representación de dibujos animados para el otro.

En este trabajo, reportamos la estructura experimental en solución de Pvfp-5β, una de las proteínas del mejillón involucradas en la adhesión a la superficie a través de la formación de la placa de biso. La secuencia de proteína contiene dos módulos EGF en tándem conectados por un conector. Los módulos similares a EGF son motivos conservados evolutivamente caracterizados por tres puentes disulfuro conservados, que mantienen unida una estructura que de otro modo sería demasiado pequeña para contener un núcleo hidrofóbico adecuado. Debido a la presencia de los disulfuros, por lo general se pliegan de manera estable y se encuentran en los dominios extracelulares de proteínas unidas a la membrana y en proteínas que se sabe que se secretan. Por tanto, es razonable suponer que también darán lugar a una proteína estructurada en Pvfp-5β.

En consecuencia, nuestro trabajo confirma estas expectativas y proporciona más información. En primer lugar, debe aclararse que existe cierta confusión en la literatura donde se declara que Pvfp-5β es una proteína de espiral aleatoria mientras que al mismo tiempo se reconoce que contiene motivos similares a EGF17,18,30. Es cierto que Pvfp-5β tiene bucles largos no estructurados, pero, al mismo tiempo, es completamente incorrecto considerar al EGF como una proteína intrínsecamente no estructurada: como todos los módulos pequeños (menos de 50 aminoácidos aprox.), necesita puentes disulfuro. mantenerse en su lugar, como se ve en varias neurotoxinas y en BPTI45. En consecuencia, las características del espectro de CD no son las de una bobina aleatoria, ya que el mínimo único se desplaza a 205 nm (en comparación con los 200 nm en las proteínas de bobina aleatoria) y se parece mucho al de otro módulo de proteína pequeño pero bien estructurado, el dominio WW46, que también comparte con Pvfp-5β una banda positiva alrededor de 230 nm que probablemente se deba al apilamiento de cadenas laterales aromáticas17. De acuerdo con este punto de vista, observamos toda una red de NOE intramoleculares, lo que nos aseguró que la proteína está plegada y tiene una estructura robusta incluso en ausencia de un núcleo hidrofóbico adecuado. También tenemos evidencia directa concluyente de que, en condiciones ácidas, Pvfp-5β es monomérico.

Por lo tanto, nuestros resultados difieren mucho de un artículo reciente en el que se informan los espectros de RMN tanto para Pvfp-5β30 tirosinado como DOPAminado. En este artículo, los autores mostraron espectros unidimensionales y bidimensionales, que tienen todas las características de una proteína agregada completamente desestructurada. Los mismos autores no pudieron observar NOE, que en cambio observamos ampliamente, como se espera para una proteína monomérica similar a EGF. La discrepancia es, por supuesto, posible dado que Pvfp-5β es una proteína difícil de producir, especialmente en bacterias, donde forma cuerpos de inclusión que requieren solubilizarse mediante un protocolo robusto y confiable de replegamiento.

Se ha sugerido de forma independiente que la rigidez del pliegue de Pvfp-5β es necesaria para promover la adhesión y la formación de biso. De hecho, nuestros parámetros de relajación de RMN, como hetNOE, nos permiten afirmar claramente que la columna vertebral es relativamente rígida con una mayor flexibilidad en la escala de tiempo ps-ns observada solo en los extremos y en el bucle β1/β2. Un análisis adicional del mapa de densidad espectral nos permitió identificar residuos que parecían afectados por el movimiento de la escala de tiempo de μs-ms, entre los cuales N39, en el largo bucle desordenado entre β2 y β3, es el más afectado. Por lo tanto, es razonable considerar que N39 actúa como una bisagra entre los dos módulos EGF. Tanto los residuos de lisina como los de tirosina aparecen expuestos al solvente y, por lo tanto, pueden actuar sinérgicamente para interactuar con las superficies también en ausencia de modificaciones de DOPA. La rigidez general, favorecida por la presencia de puentes disulfuro, podría ser así una característica estructural principal para realizar la función al favorecer la exposición persistente de los residuos de tirosina y lisina al solvente, maximizando la interacción con superficies y/u otras proteínas, mientras minimizando la penalización de entropía.

La distribución de pliegues y residuos también explica por qué Pvfp-5β es la proteína de primera línea en el proceso de adhesión en Perna viridis. Su forma alargada y la exposición de tantos puntos calientes de interacción son ideales para la adhesión a sustratos marinos. En base a la estructura, es fácil predecir que, en la placa de biso, los diferentes monómeros se apilarán interactuando de manera perpendicular al eje principal de las fibras, como en la cruz-β de una fibra amiloide (Fig. 5). Al considerar los otros componentes de la placa bisal, podríamos suponer razonablemente que el complejo expondrá parte de la hendidura formada por el conector no estructurado entre los dos módulos EGF. Esta hendidura podría acomodar otras proteínas del pie que podrían contribuir a la formación de fibras.

La forma alargada del Pvfp-5β y la exposición de muchos puntos críticos de interacción son ideales para la formación de fibras. Diferentes unidades pueden apilarse interactuando de forma perpendicular al eje principal de las fibras, como en la cruz-β de una fibra amiloide.

Finalmente, demostramos que DOPA no se requiere también para LLPS ya que observamos la coacervación simplemente cambiando el pH y la concentración de sal de la solución. El diferente comportamiento observado en un estudio previo30 podría explicarse nuevamente por la diferente naturaleza de las muestras. Esto está totalmente de acuerdo con nuestros resultados y los resultados de otros que muestran que la DOPA no es esencial para la adhesión17,22.

En conclusión, nuestro trabajo constituye un intento estructural directo para comprender el reconocimiento molecular de las proteínas de mejillón a nivel molecular y proporciona un modelo para la formación de placas bisales de mejillón. Nuestros resultados pueden explicar por qué DOPA puede ser importante para la coacervación de Pvfp-5β pero no contribuye a las propiedades de adhesión de esta proteína de acuerdo con la evidencia experimental17,22. DOPA puede favorecer fácilmente el empaquetamiento y una reticulación más efectiva de los monómeros en el coacervado y contribuir a su estabilidad. Quedan abiertas varias preguntas sobre el proceso de coacervación en la adhesión del mejillón: no conocemos, por ejemplo, la estequiometría compleja o la contribución relativa de los diferentes componentes, ni la cinética precisa de los eventos que pueden tener lugar. Tampoco sabemos con precisión cómo la presencia de DOPA podría influir en el modo de unión. Por lo tanto, será necesario trabajar más para abordar estas importantes cuestiones abiertas.

La clonación, la expresión bacteriana en E. coli y la purificación se lograron tal como se publicó anteriormente con ajustes menores17. Brevemente, Pvfp-5β recombinante se expresó en células BL21(DE3)pLysS E.coli como una proteína marcada con His N-terminal escindible con proteasa TEV. La expresión se indujo con isopropil-β-d-1-tiogalatopiranósido 1 mM durante 3 ha 37 °C. El marcaje se logró cultivando las células en medio mínimo utilizando sulfato de amonio 15N y glucosa 13C como únicas fuentes de nitrógeno y carbono. Las células se rompieron mediante homogeneizadores ultrasónicos. Los cuerpos de inclusión se volvieron a solubilizar en urea 8 M, NaCl 1 M, DTT 2 mM, tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,4. El sobrenadante se pasó por una columna cruda HisTrap FF de 5 ml preempaquetada con Ni-Sepharose (GE Healthcare Life Sciences). La proteína se eluyó en condiciones desnaturalizantes y reductoras con un gradiente lineal de imidazol. A continuación, se realizó el replegamiento mediante diálisis extensa a 4 °C, primero en fosfato de sodio 20 mM (pH 7,4), urea 2 M, NaCl 250 mM, glutatión reducido (GSH) 2 mM y glutatión oxidado (GSSG) 0,5 mM, luego en el mismo tampón sin urea y finalmente en fosfato de sodio 20 mM a pH 7,4 y NaCl 250 mM. La eliminación de la etiqueta His se realizó agregando proteasa TEV en una proporción molar de 1:50 a la solución de proteína e incubando a temperatura ambiente durante 2 h. La Pvfp-5β escindida se recuperó mediante cromatografía IMAC inversa. Debido a sus fuertes características adhesivas, la Pvfp-5β escindida no se recogió en el flujo de la columna como se esperaba, pero se eluyó con un gradiente escalonado de imidazol, lo que permitió su separación de la etiqueta. Luego se realizó una diálisis extensa a 4 °C en fosfato de sodio 20 mM a pH 7,4 y NaCl 250 mM para eliminar el imidazol, y luego en ácido acético al 5%, lo que permitió una fácil liofilización de la muestra de proteína. La pureza de la proteína se verificó mediante análisis SDS-PAGE. La concentración de proteína se evaluó mediante determinación espectrofotométrica UV a 280 nm (coeficiente de extinción [ε] = 26080 M−1 cm−1).

Las mediciones de RMN tridimensional para la asignación de resonancias se realizaron a 800 MHz en espectrómetros Bruker y 298 K. T1, T2 y NOE heteronucleares se midieron a 600 y 800 MHz en espectrómetros Bruker y 298 K usando secuencias de pulso estándar. Se prepararon dos muestras diferentes en tampón acetato 20 mM pH 4,5, una a una concentración de ~350 μM, la segunda a ~900 μM. Todos los espectros de RMN se procesaron con nmrPipe47 y se analizaron con el software CCpnmr48.

Los picos de 15N,1H HSQC49 permitieron identificar las resonancias de los grupos amida del esqueleto que luego se asignaron a los aminoácidos correspondientes mediante el análisis de los experimentos HN(CO)CACB50, HN(CO)CA51 y HNCA52, HNCACB53, que también proporcionaron valores de desplazamiento químico de átomos de Cα y Cβ que conducen a la asignación específica de secuencia. El espectro HNCO54 se utilizó para asignar los desplazamientos químicos del carbono carbonilo, mientras que los valores de desplazamiento químico de Hα y Hβ se asignaron mediante experimentos HBHA(CO)NH55 y HBHANH56. Se asignaron resonancias HN y N de 73 de 75 residuos no prolina y se usaron en el software TALOS +57, junto con resonancias asignadas de HA, CA, CB y CO, para la predicción empírica de los ángulos diedros ψ y ϕ, y estructura secundaria.

La asignación de la cadena lateral se realizó mediante experimentos 3D HCCH-TOCSY58, registrados individualmente para las cadenas alifáticas y aromáticas. Se usaron espectros 2D (HB)CB(CGCD)HD59 y (HB)CB(CGCD)CEHE60 para asignar los protones Hδ y Hε de residuos aromáticos. Las resonancias faltantes fueron asignadas por 13C NOESY-HSQC61.

La estructura de Pvfp-5β se calculó con ARIA2.362. Los datos de entrada fueron la secuencia de aminoácidos de Pvfp-5β, la lista de asignación de desplazamiento químico, las listas de restricciones NOE, los ángulos diédricos obtenidos por TALOS+ y los enlaces de hidrógeno obtenidos por la suite de modelado de proteínas Rosetta63. Las restricciones del puente disulfuro también se impusieron en los pares C13–C29, C31–C40, C45–C56, C50–C67 y C69–C78 según el análisis de espectrometría de masas anterior17. Se realizó un cálculo de estructura adicional imponiendo un enlace disulfuro adicional que involucraba a C8 y C19 como lo sugirieron las mediciones de relajación. Las restricciones de NOE se asignaron manualmente mediante el análisis de 3D 15N NOESY-HSQC64, 3D 13C NOESY-HSQC61 centrado en la región alifática (0–6 ppm) y 3D 13C NOESY-HSQC centrado en la región aromática (6–8 ppm). ARIA clasificó automáticamente las asignaciones NOE ambiguas a lo largo de ocho iteraciones, seleccionando los 100 mejores conformes en cada iteración. Se estableció un umbral de violación diferente para cada iteración: 200,0 para it0, 6,0 para it1, 3,0 para it2, 2,0 para it3, 1,0 para it4 e it5, 0,5 para it6 a it8. Los confórmeros con los valores de energía más bajos se utilizaron para filtrar las restricciones de distancia de los falsos positivos y asignar ambigüedades. Los cálculos de ARIA se realizaron con la elección adaptativa de tolerancia a violaciones. La tolerancia de asignación en las frecuencias de las listas de picos de NOESY fue de 0,02 ppm para 1H y de 0,4 ppm para los núcleos 15N y 13C. Se impusieron restricciones de enlaces de hidrógeno para los pares T18-Y30, K20-K28, T55-S68 y G57-Y66. Se asumió un potencial de restricción de distancia log-armónico. Este potencial se deriva de un análisis bayesiano que muestra que los NOE y las distancias derivadas siguen idealmente la distribución log-normal65,66. Se aplicó un potencial armónico logarítmico durante la segunda etapa de enfriamiento del recocido simulado y durante el refinamiento del agua. El conjunto estructural se visualizó y analizó utilizando Chimera y Pymol67,68. La validación de la calidad se realizó con PROCHECK69 y el paquete de software de validación de la estructura de proteínas (PSVS, https://www.bio.tools/psvs#!).

Los coeficientes de temperatura de cambio químico de amida 1HN de Pvfp-5β se determinaron mediante el registro de una serie de espectros bidimensionales de 15N,1H HSQC a 283, 288, 293, 298 y 303 K, utilizando un espectrómetro Bruker que funciona a una frecuencia de protones de 800,03 MHz. Todos los espectros se referenciaron a la señal del agua para cada temperatura, se procesaron con nmrPipe47 y se analizaron con el software CCpnmr48. El cambio químico del agua se refirió al ácido 3-(trimetilsilil)propano-1-sulfónico (DSS), que tiene una dependencia insignificante de la temperatura y permite un análisis imparcial por el artefacto de bloqueo de deuterio. Los valores de desplazamiento químico δHN de todos los residuos se representaron en función de la temperatura. Los datos se analizaron asumiendo que los residuos con dδHN/dT < –5 ppb/K forman enlaces H más débiles y deben considerarse puntos de ruptura de la estructura secundaria o, si se encuentran en una región no estructurada, como promotores de enlaces H con agua. Los valores de dδHN/dT > –5 ppb/K corresponden a la formación de enlaces más estrechos probablemente implicados en los elementos de la estructura secundaria70.

La dinámica de la columna vertebral de Pvfp-5β se probó a 298 K con la relajación 15N-R1, 15N-R2 y el efecto Overhauser nuclear heteronuclear {1H}–15N (hetNOE)71,72,73,74 bajo dos campos magnéticos diferentes (14,1 y 18,8). T). 15N-R1, 15N-R2 y {1H}–15N NOE también se midieron a otras tres temperaturas (288, 293 y 303 K) bajo el campo magnético único de 18,8 T. En todos los casos, R1 y R2 se midieron con retrasos. variando de 0.01 a 2 s, y entre 0.017 y 2.7 s, respectivamente. Los datos de NOE en estado estacionario de {1H}-15N se obtuvieron midiendo dos espectros: un espectro inicial registrado sin la saturación de protones inicial y un segundo espectro registrado con una saturación de protones inicial de 8 s. A continuación, se determinaron los valores de NOE a partir de las proporciones de las intensidades medias de los picos con y sin saturación de protones.

Los datos de relajación adquiridos a 298 K, obtenidos con campos magnéticos de 18,8 T y 14,1 T, se analizaron mediante el formalismo matemático Modelfree estándar75 disponible en la herramienta Dynamic Center proporcionada por la plataforma topspin de Bruker. Los datos experimentales se procesaron y ajustaron utilizando dos estructuras diferentes con 5 y 6 puentes disulfuro. Se llevó a cabo un análisis adicional de los datos de relajación adquiridos a diferentes temperaturas utilizando el enfoque de la función de densidad espectral31,32. La temperatura se comprobó monitorizando los cambios de desplazamiento químico de los picos seleccionados. No se observó sobrecalentamiento de la muestra como resultado de la aplicación de pulsos de radiofrecuencia. De los 83 aminoácidos presentes, quince residuos fueron excluidos del análisis por ser prolinas o por solapamiento en el HSQC 15N (P5, P7, P10, Y11, P12, C13, G37, A44, P47, P49, Y58 , Y60, P63, P70, G75).

Los modelos estructurales de Pvfp-5β se obtuvieron utilizando la suite RoseTTafold76. Esta es una de las herramientas computacionales basadas en redes de aprendizaje profundo capaces de predecir la estructura de proteínas a partir de su secuencia de aminoácidos. La red de aprendizaje profundo puede realizar una serie de operaciones de convolución 1D, 2D y 3D para aumentar la precisión del modelo estructural de proteínas resultante. Las combinaciones de múltiples alineaciones de secuencias, mapas de distancia y representaciones de coordenadas tridimensionales dan lugar a un mejor modelo estructural en comparación con los métodos de predicción más tradicionales basados ​​en múltiples alineaciones de secuencias y mapas de contacto. El software generó cinco modelos, cuyas diferencias se destacan como estimaciones de error de angstrom frente a la posición de cada residuo en la secuencia. La bondad de la predicción se define por un nivel de confianza, que está relacionado con la lDDT (prueba de diferencia de distancia local) predicha que se usa en DeepAccNet77. Obtuvimos un nivel de confianza de 0.92 para Pvfp-5β.

La Pvfp-5β liofilizada se disolvió en ácido acético 10 mM hasta la concentración final de 10 mg/ml. A continuación, la solución se diluyó a 1 mg/ml en acetato de sodio 20 mM a pH 4,5 o Tris-HCl 0,1 M a pH 8 y NaCl 1 M, y se tiñó con una solución acuosa de ThT 40 µM. Se colocaron 250 microlitros de muestras teñidas en portaobjetos con cámara de microscopio y se tomaron imágenes a una resolución de 1024 × 1024 píxeles usando un microscopio de escaneo láser confocal Leica TCS SP5, usando un objetivo de aceite 63x (Leica Microsystems, Alemania). El láser de luz blanca de Leica se ajustó a una excitación de 470 nm y se detectó emisión de ThT en el rango de 485 a 585 nm.

Los datos FLIM se adquirieron en el dominio del tiempo por medio de un módulo TCSPC independiente picoHarp 300 (Picoquant), utilizando un objetivo de aceite de 63x (Leica Microsystems). Se adquirieron imágenes de 256 × 256 píxeles a una frecuencia de exploración de 200 Hz, con un láser de luz blanca Leica configurado para excitar ThT (λex: 470 nm, λem: 485–585 nm). La calibración FLIM del sistema se realizó midiendo el tiempo de vida conocido de la fluoresceína, que es un tiempo de vida único de 4,0 ns. Los datos FLIM se analizaron mediante el enfoque fasorial42,43 mediante el software SimFCS desarrollado en el Laboratorio de Dinámica de Fluorescencia de la Universidad de California en Irvine (www.lfd.uci.edu). El enfoque fasorial es una técnica de dominio de Fourier que permite el análisis gráfico de las mediciones FLIM. Transforma el decaimiento de la fluorescencia medido en cada píxel de la imagen en un solo punto llamado "fasor" en una representación polar. Todas las posibles desintegraciones exponenciales simples se encuentran en un semicírculo (definido como círculo universal), con radio 1/2, que va desde el punto (0, 0), correspondiente a τ = ∞, al punto (1, 0), correspondiente a τ = 0. Los decaimientos complejos son combinaciones lineales de exponenciales simples y se representan dentro del semicírculo. Dado que los fasores siguen el álgebra vectorial, es posible resolver geométricamente las fracciones de dos especies fluorescentes (en el caso más simple) mediante la regla de la palanca de las sumas vectoriales. La combinación lineal de dos componentes de decaimiento exponencial simple genera fasores dentro del círculo universal, que se encuentran en una línea recta que une los fasores de los dos componentes individuales. La contribución/fracción de un solo componente a la vida útil es proporcional a la distancia del fasor a este.

Para las mediciones de Pvfp-5β, las distribuciones de vida útil se seleccionaron con un cursor verde, cian y rojo y los píxeles correspondientes se localizaron con el mismo código de color en las imágenes. Los píxeles verdes están relacionados con vidas más cortas. Las vidas útiles que aumentan progresivamente se mapean usando colores cian y rojo.

Los cálculos de acoplamiento de las interacciones proteína-proteína para el complejo Pvfp-5β/Pvfp-5β se realizaron ab-initio utilizando la plataforma de modelado integrador HADDOCK2.478,79. Durante el protocolo de acoplamiento HADDOCK, los socios que interactúan se tratan como cuerpos rígidos en la etapa inicial, mientras que la segunda etapa introduce flexibilidad a los socios que interactúan a través de un refinamiento basado en la dinámica molecular de tres pasos para optimizar el empaquetamiento de la interfaz. A continuación, se permite que los residuos que pertenecen a la región de interfaz muevan sus cadenas laterales en un segundo paso de refinamiento. Luego se realiza un refinamiento final en una capa de solvente para mejorar la energía de la interacción. Los complejos proteína-proteína resultantes se clasifican en función de la puntuación HADDOCK, que es una suma ponderada de varios términos, como energías electrostáticas, de van der Waals y de restricciones de distancia, y área de superficie enterrada.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

La asignación de RMN se envió a BioMagResBank (BMRB: www.bmrb.wisc.edu, https://doi.org/10.1093/nar/gkm957) con el número de acceso 51091. Las coordenadas de la estructura de RMN se depositaron en Protein Data Bank (PDB: www.rcsb.org, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7000-1_26) bajo el código de acceso 7QAB. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente a petición razonable.

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El trabajo en Fondazione Ri.MED fue apoyado por Patto per il Sud Regione Siciliana—Grant "CheMISt" (CUP G77B17000110001), y PO FESR Sicilia 2014/2020 Azione 1.5.1.—Grant "Potenziamento Infrastruttura di Ricerca" GMP Facility, Laboratori di Ricerca e Servizi Diagnostici e Terapeutici IRCCS-ISMETT" (CUP G76G17000130007), Asociación IRCCS-ISMETT/Fondazione Ri.MED. AP recibió el apoyo del Francis Crick Institute a través de la provisión de acceso al MRC Biomedical NMR Centre. El Francis Crick Institute recibe su financiación básica de Cancer Research UK (FC001029), el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (FC001029) y Wellcome Trust (FC001029). Nos gustaría agradecer al Centro ATeN de la Universidad de Palermo por el apoyo a las infraestructuras. También agradecemos a Nadia Consiglio por su amable ayuda en la realización de la Fig. 5.

Estos autores contribuyeron igualmente: Maria Agnese Morando, Francesca Venturella.

Unidad de Biología Estructural y Biofísica, Fondazione Ri.MED, 90133, Palermo, Italia

María Agnese Morando, Francesca Venturella, Martina Sollazzo, Elisa Monaca, Raffaele Sabbatella & Caterina Alfano

Departamento de Ciencias y Tecnologías Biológicas, Químicas y Farmacéuticas (STEBICEF), Universidad de Palermo, 90128, Palermo, Italia

martina sollazo

Departamento de Física y Química—Emilio Segrè (DiFC), Universidad de Palermo, 90128, Palermo, Italia

Valeria Vetri

Instituto de Biofísica, Consejo Nacional de Investigación, 90143, Palermo, Italia

Rosa Passantino

Instalación europea de radiación de sincrotrón, Ave des Martyrs, 38000, Grenoble, Francia

Pastora Annalisa

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conceptualización de CA y AP; preparaciones de muestras FV, ​​EM, RS y RP; Adquisición de datos CA, MAM y MS; análisis de datos MAM, FV, MS, VVAP y CA; curación de datos AP y CA; AP y CA escribieron el manuscrito; Supervisión de CA, adquisición de recursos y financiación.

Correspondencia a Caterina Alfano.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este manuscrito ha sido revisado previamente en otra revista de Nature Portfolio. El manuscrito se consideró adecuado para su publicación sin revisión adicional en Communications Biology. Editor de manejo principal: Gene Chong.

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Reimpresiones y permisos

Morando, MA, Venturella, F., Sollazzo, M. et al. La estructura de la solución de Pvfp-5β recombinante revela información sobre la adhesión del mejillón. Commun Biol 5, 739 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03699-w

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Recibido: 02 febrero 2022

Aceptado: 11 julio 2022

Publicado: 25 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03699-w

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